Durante o primeiro tempo da era geológica, nossos ancestrais foram bactérias. A maioria das criaturas continuam à se-lo, e cada uma das trilhões de células do nosso corpo é uma colônia de bactérias. (Richard Dawkins)

Você sabia que 75 a 90% das células do nosso corpo são microbianas? Essas células compõem o que é chamado de microbioma humana. Essas células tem um papel importante também quando morremos, por isso nos últimos dez anos estão sendo investigadas nas pesquisas na área forense, principalmente para a Biologia forense e Medicina Legal, área ao qual encontramos a maior parte dos artigos sobre o assunto.

A pesquisa Human Microbiome Project (HMP) envolveu cerca de 80 universidades e instituições de pesquisa de 2007 a 2016. Semelhante ao projeto de mapear o sequenciamento genético humano, a pesquisa envolveu estudar e catalogar os microrganismos que habitam todas as partes do nosso corpo, mapeando a composição microbiana normal de indivíduos saudáveis. Foi identificado nesse projeto que todos nós carregamos microrganismos patógenos, o que diferencia é que em organismos saudáveis esses microrganismos patógenos não causam doença pois vivem uma relação de simbiose (relação harmônica). Quando essa relação deixa de ser harmônica, esses patógenos podem causar uma doença.

O que não se sabia, era o que acontecia com as células microbianas após a morte. O que se sabe é que as células humanas após a morte sofrem com a hipóxia: com o sangue parando de circular há diminuição das taxas de oxigênio no sangue arterial ou nos tecidos, pois a hemoglobina para de carregar oxigênio.  Quando ocorre a hipóxia, as organelas passam a se degradar por causa de enzimas autolíticas que quebram as membranas celulares. Essa quebra na membrana faz com que seja liberado ao meio extracelular nutrientes como aminoácidos, gorduras, água e sais minerais. Esses nutrientes fazem parte dos componentes utilizados pelas bactérias para o crescimento, portanto é criado um ambiente propício para o crescimento da população microbiótica. Mas não é apenas isso. Falamos da hipóxia, o que ela contribui? Simples, com a diminuição dos níveis de oxigênio na circulação, temos alteração no padrão de fermentação, pois a fermentação anterior era aeróbia (precisava de oxigênio para acontecer), passando para fermentação anaeróbica, utilizando-se das altas concentrações de gases como metano, dióxido de carbono, dióxido de enxofre e hidrogênio.

Considerando um indivíduo saudável, órgãos como cérebro, fígado, coração e baço deverão ser desprovidos de microrganismos, tendo em vista que o sistema imunológico está saudável e, portanto, sob controle. Após a morte, o sistema imune deixa de funcionar e não há meios de combater os microrganismos, portanto eles acabam se proliferando em larga escala. Essa proliferação começa a partir dos intestinos, seguindo para o fígado, baço, coração e por último o cérebro. As demais áreas do corpo são atingidas por causa da invasão das bactérias no sistema vascular e linfático. Chegando aos vasos capilares, as bactérias chegam aos demais tecidos. Também ocorre invasão das mucosas do aparelho respiratório. A identificação dessas bactérias que invadem os tecidos desses órgãos não é definida em sua totalidade. Mas então, quais os motivos dos cientistas terem interesse no microbioma dos órgãos internos? Porque diferentemente dos tecidos externos, tais como a mucosa oral e pele, eles são menos afetados em sua totalidade pelas variações de condições ambientais, de fatores intrínsecos e extrínsecos. A ciência forense está estudando esses órgãos, usando métodos diferenciados de cultura bacteriana a fim de identificar que a presença, ausência ou abundância de determinados microrganismos são essenciais para solucionar causas de morte desconhecidas e também como novo método de estimativa de tempo de morte.

Sabendo disso, os microbiologistas forenses estão pesquisando sobre as mudanças dinâmicas no microbioma humano após a morte, sua estrutura e função, que passaram a ter denominações específicas como thanatomicrobioma (thanato vem de thanatos, que em grego significa morte) e comunidades epinecróticas, que são microorganismos específicos de restos que estão em processo de decomposição. Um dos nomes mais significativos na pesquisa da microbiologia forense é o da pesquisadora Gulnaz Javan, cujo laboratório na Universidade Estadual do Alabama estuda a decomposição cadavérica desde à morte até a última fase da decomposição. Ela realizou estudos em amostras de cadáveres desde 2013, e tem muitos artigos publicados nas principais plataformas de pesquisas em ciências forenses. Foi Gulnaz Javan que criou os termos Thanatomicrobioma e Postmortem Clostridium Effect (PCE).

Antes de falarmos sobre o objetivo do estudo do Thanatomicrobioma, vamos falar sobre estimativa post-mortem (PMI, em inglês, ou IPM, de Intervalo pós-morte). Quando falamos de ciência forense e investigação de locais de morte suspeita, um dos pontos abordados em toda investigação é o levantamento desse intervalo que visa estabelecer o tempo mínimo e máximo que passou desde a morte até o encontro do corpo pela equipe de investigação. Podemos dizer que o intervalo post-mortem é inversamente proporcional à sua estimativa, pois quanto maior o intervalo, menor a possibilidade de obter uma estimativa precisa. Essa estimativa é dada mediante diversas análises dentro do contexto médico-legal, tais como:

• Avaliação visual dos estágios de decomposição, sendo este, historicamente, o método primário para se estimar o PMI. Porém, a decomposição trata-se de um processo de sucessões de modificações corporais que podem se alterar muito de acordo com o tipo de ambiente ao qual o cadáver se encontra;
• Utiliza-se também critérios de temperatura corporal (esfriamento do cadáver, também conhecido como algor mortis), rigidez cadavérica (rigor mortis), alteração da cor da pele e manchas de hipóstase (livor mortis). Essas manifestações são conhecidas como fatores de alterações abióticas e sua precisão é considerada aceitável dentro de 36 horas após a morte;
•  Uso de entomologia forense como medidor, através da análise do desenvolvimento morfológico, tendo como critério o conhecimento dos estágios de desenvolvimento de determinados insetos necrófagos (moscas Calliphoridae, Sarcophagidae, por exemplo). Porém, para considerar este método, temos de considerar que ele é aplicável em casos ao qual os insetos possam ter acesso ao cadáver.

O uso do thanatomicrobioma como biomarcador de estimativa de intervalo pós-morte.

O termo thanatomicrobioma considera todos os microrganismos, não somente bactérias, também são citados os fungos. Essas evidências microbióticas podem fornecer informações relevantes nas investigações médico-legal.  Em 1916, Fredette, após a dissecção de cadáveres, realizou um experimento ao qual detectou microrganismos cultiváveis em 35% dos casos que dissecava. Além disso, detectou também que esses microrganismos aumentavam conforme o intervalo pós-morte também aumentou. Pesquisas sobre o thanatomicrobioma descobriram que o fígado, de todos os órgãos internos, é o órgão que mais possui diversidade microbiana e isso se deve aos seguintes fatores, ligados à anatomia e fisiologia do corpo humano:

– O fígado é o maior órgão do nosso corpo, possuindo uma massa de 1400 a 1800 gramas, lembrando que o fígado é responsável por metabolizar e armazenar nutrientes. Por isso que quando exageramos na dose, o nosso fígado grita.

– O fígado recebe sangue através da veia porta hepática e artéria e sua localização no trato gastrointestinal fica perto de órgãos com alta carga microbiana.

– Após a morte, as enzimas pancreáticas, suco estomacal e líquidos da vesícula biliar dão o pontapé inicial para o processo de decomposição, gerando processo de destruição de células (autólise), que se espalha muito rápido para o fígado.

O primeiro estudo significativo sobre o Thanatomicrobioma

Para o levantamento do thanatomicrobiama, Javan e sua equipe de cientistas forenses coletaram amostras de cadáveres cerca de 20 a 240 horas após a morte. O primeiro estudo foi publicado em 2014, chamado Distinctive thanatomicrobiome signatures found in the blood and internal organs of humans (“Identificações de thanatomicrobioma encontradas no sangue e nos órgãos internos dos seres humanos”).

Neste primeiro estudo, 11 cadáveres foram mantidos no Departamento de Forense do Alabama, na geladeira do Necrotério do Laboratório de Ciências Médicas, mantidos a 1 ° C. As necrópsias foram realizadas com climatização de 20° C. As coletas realizadas nos cadáveres foram transportadas dentro de um refrigerador para a Universidade do Estado do Alabama, onde foram mantidas em um freezer sob temperatura de -80° C até o dia da análise no laboratório de microbiologia. Após a necropsia, foram coletadas informações como idade, sexo, altura, etnia, peso, tempo estimado de morte e temperatura retal. Durante a necropsia. Foram utilizados bisturis estéreis para dissecção do cérebro, coração, fígado e baço. As porções desses órgãos foram armazenadas em sacos plásticos estéreis e o sangue foi coletado do coração, utilizando-se também de seringa esterilizada.

Das 19 amostras preparadas a partir dos 11 cadáveres, sendo que todos neste primeiro estudo tinham o tempo pós-morte conhecido, variando de 20 a 240 horas. A primeira detecção de RNA bacteriano apareceu na amostra de fígado de um cadáver com intervalo de pós-morte (PMI)  de 20 horas. A primeira detecção de presença bacteriana em todos os órgãos e tecidos das amostras foram encontradas em um cadáver com PMI de 58 horas. Essas amostras forneceram um prazo ideal para estudo da thanatomicrobioma em órgãos e tecidos. Até o momento desse primeiro estudo realizado em 2014, no mundo havia dois estudos que fizeram uma analise do microbioma pós-morte, analisando sangue e órgãos de dois cadáveres provenientes de morte por afogamento, porém não foi possível comparar resultados, pois o método de extração e amplificação de material genético microbiológico eram diferentes. Como ponto interessante do estudo envolvendo mortes por afogamento, identificou-se diferenças nas comunidades microbióticas nas amostras de fígado e coração em um mesmo cadáver. As diferenças encontradas em um mesmo cadáver foram atribuídas às bactérias que entraram nos pulmões junto com a água. Outro estudo que surgiu antes da pesquisa de Gulnaz Javan, foi o estudo sobre as amostras coletadas na boca e no reto, de dois cadáveres em decomposição, após a fase de pós-inchaço. Neste estudo foi observado mudança das bactérias aeróbicas e anaeróbicas dentro do mesmo corpo. Não podem ser utilizadas como fins de comparação, pois o método de extração de material genético também foram diferentes.

Como resultados desse primeiro estudo confirmou a presença de infecção antes da morte, o que pode ser útil nos casos de identificação de causa de morte desconhecida. Detectado também que as amostras bacterianas são encontradas no fígado a partir de 20 horas após a morte e nos demais órgãos, à partir das 58 horas. De acordo com Gulnaz Javan, isso é significativo porque a microbiologia é validada à partir de métodos tradicionais de cultura e sabe-se que é uma fração muito pequena de bactérias que podem ser cultivadas. Utilizando abordagens de biologia molecular, não foi necessário o uso de meios de cultura, sendo possível obter um resultado melhor de quem são esses microrganismos protagonistas desse microbioma. Considerando também que as necropsias são realizadas cerca de 24 a 48 horas após a morte, os valores obtidos na investigação da microbiota cadavérica apoiam-se no contexto da estimativa de tempo pós-morte do cadáver, pois as primeiras microbiotas post-mortem são detectadas após 20 horas da morte. Após a amplificação dos dados genéticos, esse primeiro estudo mostrou que o thanatomicrobioma é predominado por bactérias anaeróbicas facultativas (podem ou não fazer o uso de oxigênio), tal como Lactobacillus, que são predominantes em órgãos e amostras de sangue de cadáveres com curto intervalo de tempo pós-morte. Nos cadáveres com tempo de intervalo mais longos foram encontrados a bactéria anaeróbia Clostridium. Essa bactéria, em estudo posterior ao de 2014, serviu como importante biomarcador de PMI. Em resumo, o uso de tecnologia de ponta, como sequenciamento de material genético considerando intervalos de tempo após a morte, aliado à uso de bioinformática para detecção de padrões, permitiu encontrar um pedaço de um quebra-cabeça complexo.

Esse estudo mostrou que é viável utilizar o thanatomicrobiano de tecidos de órgãos e amostras de sangue de cadáveres usando métodos de extração e amplificação de DNA, além de definir de encontrar uma técnica que proporcionasse mais produtos de amplificação através de técnicas de PCR. A análise em cadáveres diferentes sugeriu que o thanatomicrobioma possui semelhança entre os tecidos de órgãos e amostras de sangue de um mesmo cadáver. As bactérias anaeróbicas facultativas (que podem ou não usar oxigênio para metabolismo energético) como as Lactobacillus são predominantes em tecidos e sangue de cadáveres que possuem PMI mais curtos. Para os PMI mais longos, foi identificado que bactérias anaeróbicas como a Clostridium são predominantes.

Em reforço ao estudo realizado por Javan, um estudo de 2015, desenvolvido por pesquisadores do Havaí e da Austrália, também pesquisou sobre os aspectos ecológicos de bactérias aeróbicas de cadáveres, porém utilizando carcaças de porcos e meio de cultura, mostrando também que em um mesmo cadáver podem hospedar bactérias distintas. Nesta investigação foi coletado comunidades bacterianas aeróbias da pele e de massa de larvas de insetos e observado que essa comunidade muda com o decorrer do tempo, coincidindo também com a mudança de pH, que passou de alcalino para ácido, sendo dependentes de intervalos de morte diferentes, porém os filos mantiveram-se sempre dominados por Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria.

Também em 2015, foi publicado no periódico Journal of Forensic Sciences um estudo de pesquisadores forenses da Universidade do Tenesse ao qual estudaram a microbiota pós-morte de comunidades do intestino para verificar alterações que poderiam ser quantificadas, de acordo com o passar do tempo.  As comunidades microbianas presentes no intestino grosso são dominadas por colônias de Bacterioidetes (Bacteroides spp), Firmicutes (Lactobacillus spp.). Encontra-se também populações menores de Proteobacteria (Escherichia spp.) e Actinobacteria (Bifidobacterium spp). A composição do microbioma intestinal é consistente o suficiente para ser distinto de outras comunidades, tais como as do solo e da água. Após a morte, devido à autólise, libera-se substrato para as bactérias comensais, que vão fermentar os subprodutos da autólise causando o inchaço cadavérico. Os pesquisadores postularam que as mudanças que ocorrem no produto da decomposição e os substratos disponíveis contribuem para a seleção e sucessão dessas populações de bactérias.

A microbiota intestinal foi testada à partir do intestino grosso de 12 cadáveres decompostos em condições ambientais. Os cadáveres doados para o estudo não passaram por necropsia e embalsamamento e não tinham doenças intestinais, para que o estudo não fosse comprometido. Foram deixados em decúbito dorsal e sem roupa em locais variados da Anthropological Research Facility (ARF) em Knoxville, Tennessee e coletados material intestinal usando materiais estéreis. As amostras foram armazenadas em gelo em um refrigerador para transporte para laboratório em que foram pesados e armazenados em 20°C até processamento posterior. Três amostras foram coletadas em
cada ponto do tempo para cada cadáver. Nesses cadáveres foram encontrados três gêneros bacterianos que foram quantificados através de técnicas laboratoriais de PCR quantitativo (qPCR). Observou-se que com o passar do tempo (aumento do PMI), as comunidades de Bacterioides e Lactobacillus tiveram diminuição exponencial, porém a comunidade de Bifidobacterium não teve mudanças significativas, sendo então, utilizado as Bacterioides e Lactobacillus como indicadores quantitativos de PMI.

O trabalho demonstrou que algumas bactérias podem ser usadas para estimar intervalos dos primeiros 20 dias de PMI. Como vantagens, foi mostrado que os métodos baseados em análise de DNA/RNA, com análises baseadas em técnicas de PCR promove a estimativa mesmo que o cadáver tenha sido removido do local original de decomposição. O estudo não considerou efeitos sob diferenças de sexo, peso ou causa de morte, sendo que neste quesito, o exigido é que o indivíduo não tivesse doenças que afetassem os intestinos. Para que a pesquisa tenha resultados mais amplos, pesquisas futuras necessitam realizar validações de outras abordagens, como por exemplo, outras variações de ambiente (temperatura e umidade, por exemplo). Os cadáveres utilizados no estudo eram todos provenientes do sudeste norte americano, sendo necessário replicar em indivíduos com estilos de vida e localizações diferentes, observando as diferenças de dieta e estilo de vida. Os pesquisadores acreditam que o método utilizado forneceu uma estimativa precisa do intervalo post-mortem, contribuindo para que o perfil microbiológico seja suficiente para que dentro de um contexto médico-legal seja utilizado para identificação.

Em 2016, Gulnaz Javan teve uma publicação na Nature, intitulada Human Thanatomicrobiome Succession and Time Since Death (“A sucessão do Thanatomicrobioma Humano e tempo pós-morte”), ao qual discorre sobre recentes descobertas científicas sobre o microbioma colonizadores de órgãos após a morte, enfatizando que a maioria das bactérias no corpo humano após a morte são anaeróbicas obrigatórias (Clostridium spp.). Foi utilizado 27 cadáveres humanos provenientes de casos criminais cujos intervalos pós-morte variavam de 3 a 240 horas. Neste estudo, a pesquisadora enfatizou que a detecção de microrganismos mediante um padrão, criando uma espécie de “catálogo de thanatomicrobioma” é fundamental para que se tenha uma assinatura de cada órgão e assim auxiliar microbiologistas forenses para as estimativas pós-morte.

Estudiosos do thanatomicrobioma apontam que estudos futuros vão abordar uma padronização para coleta dos tecidos e resíduos pós-morte, assim como a padronização de protocolos de extração de DNA (alguns métodos de extração, no decorrer das pesquisas demonstraram maior amplificação no PCR) e plataformas de sequenciamento. O próximo passo a ser dados é a criação de um banco de dados forenses para médicos e pesquisadores forenses ao qual se estudaria a função desses microrganismos na estimativa de tempo pós-morte e investigações de causas de morte. Fortalecer pesquisas e padronizações de protocolos é fundamental para que se avance na importância de dar voz à microbiologia forense e suas aplicações. No Brasil, não temos estudos sobre o thanatomicrobioma, mas encontrei alguns estudos sobre a fauna micológica (fungos) cadavérica, que acabou entrando na lista para tema de outra publicação aqui no Ciência Contra o Crime. Acredito que o Brasil ainda tem muito à caminhar nesta área, sendo que mesmo que em países mais desenvolvidos, como os Estados Unidos, ao qual tem predominância em estudos nessa área, o estudo do thanatomicrobioma ainda é restrito, mas não deixa de ser uma área promissora para as investigações criminais.

Para quem gostou da matéria e quer treinar o inglês, tem este podcast no link abaixo, ao qual a Dra. Javan participa e conta um pouco do projeto sobre Thanatomicrobioma:

Thanatomicrobioma – Podcast MicrobeTalk

Até a próxima!

Referências:

Distinctive thanatomicrobiome signatures found in the blood and internal organs of humans – acessado em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25091187

NIH Human Microbiome Project defines normal bacterial makeup of the body – acessado em https://www.nih.gov/news-events/news-releases/nih-human-microbiome-project-defines-normal-bacterial-makeup-body

Human Microbioma Project – https://commonfund.nih.gov/hmp

The Thanatomicrobiome: A Missing Piece of the Microbial Puzzle of Death – acessado em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4764706/

Javan, G., Finley, S., Can, I. et al. Human Thanatomicrobiome Succession and Time Since Death. Sci Rep 6, 29598 (2016). https://doi.org/10.1038/srep29598

L.P. Chun, et al., An initial investigation into the ecology of culturable aerobic postmortem bacteria, Sci. Justice (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.scijus.2015.07.003

Hauther K. A., Cobaugh K. L., Jantz L. M., Sparer T. E., DeBruyn J. M. (2015). Estimating time since death from postmortem human gut microbial communities. J. Forensic Sci. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26096156